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Il trapianto autologo di cellule staminali ematopoietiche (CSE)

Foto trapianto autologo

 

  • introduzione

    Il trapianto autologo di cellule staminali ematopoietiche (CSE) consiste nella somministrazione di chemioterapia +/- radioterapia ad intensità sovra-massimale (denominata di “condizionamento”) seguita da una reinfusione delle CSE del paziente stesso, che è quindi al contempo donatore e ricevente, raccolte e congelate prima della terapia.
    Il razionale su cui si basa il trapianto autologo di CSE è legato alla spiccata chemio sensibilità di molte neoplasie ematologiche, che hanno la capacità di rispondere e quindi andare incontro ad eradicazione, dopo somministrazione di dosaggi elevati di chemioterapia. Tuttavia, la somministrazione di tali dosaggi, pur avendo la capacità di eradicare la malattia, è gravata da una serie di tossicità, la più importante delle quali è quella midollare. In altre parole, il condizionamento può assicurare un buon controllo della malattia ma con una grave tossicità sul midollo osseo ematopoietico, e distruzione dei precursori delle cellule del sangue. La reinfusione di CSE, precedentemente raccolte e conservate, è in grado di determinare una rigenerazione del midollo osseo e quindi di superare questo grave effetto collaterale di condizionamento. Si possono così somministrare dosaggi elevati di chemioterapia con la massima efficacia sul controllo della malattia evitando però la possibilità di distruzione completa ed irreversibile del midollo osseo ematopoietico.  

    Il primo caso  di uso di CSE autologhe è stato descritto nel 1959 in una bimba affetta da leucemia acuta linfoblastica, sebbene qualche caso “aneddotico” fosse già stato riportato e pubblicato alla fine dell’800. Solo nel 1978 è stato tuttavia pubblicato dai medici americani del National Cancer Instituite il primo studio prospettico in cui l’autotrapianto di CSE veniva normalmente utilizzato in pazienti con linfoma in fase avanzata di malattia. Da allora, fino ad oggi si è assistito ad un progressivo e continuo incremento del numero dei trapianti autologhi effettuati con una sempre maggiore estensione delle indicazioni: basti pensare che nel 2010 su 653 centri afferenti allo European Blood and Marrow Transplantation Group sono state effettuate un totale di 20.017 procedure di trapianto autologo di CSE.

    Per comprendere meglio la procedura del trapianto autologo di CSE, possiamo didatticamente dividere il percorso del paziente da avviare a trapianto in 5 tappe successive.

  • Raccolta delle CSE

    La metodica originale per raccogliere le CSE (precursori emopoietici, note anche come cellule CD34-positive per la presenza sulla loro superificie di questa molecola distintiva) è stata per circa un decennio il prelievo di midollo osseo ematopoietico. Il paziente veniva sottoposto a numerose aspirazioni di midollo osseo dalle creste iliache posteriori (generalmente in sala operatoria, in anestesia generale o in alternativa in loco-regionale spinale), prelevando un totale di 1-2 litri di sangue contenente midollo osseo ematopoietico. In tal modo si otteneva una quantità di CSE adeguata per assicurare una ricostituzione midollare completa dopo chemio-radioterapia mieloablativa. La procedura richiedeva circa due ore per essere completata ed il paziente veniva generalmente sottoposto ad 1-2 trasfusioni di emazie concentrate a causa dell’elevata quantità di sangue prelevata. Già dai primi anni ’80 era tuttavia nota un’altra modalità di raccolta delle CSE, che progressivamente ha sostituito fino a prevalere quasi completamente su quella tradizionale: la raccolta delle CSE dal sangue venoso periferico.
    Sebbene in condizioni normali le CSE CD34-positive sono presenti nel sangue venoso periferico in piccolissime quantità, dopo somministrazione di fattori di crescita granulocitari (Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF) associata o meno a chemioterapia con alcuni farmaci così detti “mobilizzanti” (Ciclofosfamide, Citarabina, Ifosfamide), il numero di queste cellule nel sangue periferico aumenta enormemente (fenomeno della “mobilizzazione”). Quando si verifica una simile evenienza, le CSE da sangue periferico vengono raccolte mediante un separatore cellulare a flusso continuo ad una velocità di aspirazione del sangue di 30-70 ml/minuto con una centrifuga interna predisposta in modo da separare dagli altri elementi ematici una frazione di cellule mononucleate contenenti le CSE, grazie alla presenza del loro “marcatore” CD34. Al fine di effettuare tale raccolta, oggi, più frequentemente, si utilizza un catetere venoso centrale a doppio o triplo lume da rimuovere al termine della procedura di aferesi, per garantire adeguati volumi di scambio.
    Una procedura standard prevede che vengano processati 10-15 litri di sangue intero in un tempo di 3-5 ore valutando, al termine, la conta cellulare e le cellule CD34-positive.
    La quantità di CSE CD34-positive da raccogliere dipende dal numero di trapianti che si intendono effettuare, dall’intensità della chemioterapia di condizionamento e dalla patologia per la quale si effettua il trapianto. Generalmente, al fine di assicurare al paziente un’adeguata ricostituzione midollare dopo somministrazione di chemio e/o radioterapia mieloablativa, è necessario re infondere un numero di CSE CD34-positive pari a 2-5 x 106/kg. In altre parole, per un uomo che pesa 75 Kg, sono necessarie almeno 150.000.000 di cellule staminali emopoietiche per ripopolare e ricostituire in maniera adeguata il midollo osseo dopo che lo stesso è stato distrutto dalla somministrazione di alte dosi di chemioterapia e/o radioterapia. Nei pazienti con quantità adeguate di cellule CD34-positive circolanti, un’accurata procedura consente di raccogliere il totale delle cellule staminali necessarie per un trapianto. In altri casi, quelli con basse quantità circolanti di precursori emopoietici o che dovranno essere sottoposti a più di una procedura trapiantologica, possono essere necessarie più sedute di leucoaferesi. E’ necessario sottolineare, tuttavia, che circa il 25% dei pazienti sottoposti a mobilizzazione, non è in grado di raggiungere un adeguato numero di CSE CD34-positive nel sangue venoso periferico e quindi fallisce il tentativo di raccolta. Negli ultimi anni sono stati immessi sul mercato dei nuovi farmaci “mobilizzanti” da associare al G-CSF e alla chemioterapia, utili proprio in questi pazienti noti come “cattivi mobilizzatori”. Il principale di questi farmaci è il Plerixafor ed è in grado, mediante un complesso meccanismo di azione, di aumentare la capacità di mobilizzazione anche in questi pazienti.

    Nonostante i nuovi farmaci, rimane tuttavia una percentuale di pazienti in cui non è possibile effettuare la mobilizzazione e in cui è necessario ricorrere all’espianto di midollo osseo ematopoietico al fine di ottenere un adeguato numero di CSE CD34-positive per effettuare in regime di sicurezza la procedura di trapianto autologo.

  • Criopreservazione delle CSE

    Una volta raccolte, quale che sia la modalità di raccolta, le CSE devono essere conservate in maniera adeguata al fine di evitarne il deterioramento.

    Negli ultimi venti anni sono state proposte diverse metodiche di congelamento a temperature variabili tra -80 e -196°C, arrivando addirittura a non congelare le cellule staminali nei casi in cui il regime di condizionamento sia di breve durata ed il tempo che intercorre tra la raccolta di cellule emopoietiche e la loro reinfusione non superi le 96-120 ore. Per permettere alle CSE di sopravvivere a queste temperature è necessario proteggere queste cellule diluendole in un agente “crioprotettivo” noto con il nome di Dimetilsulfossido (DMSO), una molecola in grado di diffondere rapidamente all’interno della cellula attraverso la membrana plasmatica riducendo il numero e le dimensioni dei cristalli di ghiaccio intracellulari che altrimenti danneggerebbero la membrana e gli organuli cellulari e proteggendo le cellule dalla disidratazione.

    L’utilizzo del DMSO a concentrazione pari al 10% del volume della sospensione cellulare garantisce una buona conservazione delle cellule staminali ed un effetto tossico contenuto nei pazienti sottoposti a reinfusione. Le CSE correttamente criopreservate, possono essere utilizzate in qualsiasi momento dopo scongelamento e rimangono integre e vitali anche per lunghi periodi (es. 10-15 anni).

  • Condizionamento delle CSE

    Il condizionamento consiste nella somministrazione di chemioterapia +/- radioterapia a dosaggi sovra-massimali nei giorni prima dell’infusione delle CSE. Il condizionamento, se da una parte ha l’obiettivo di “preparare” il midollo osseo del paziente a ricevere le CSE, ha anche come principale obiettivo quello di cercare l’eradicazione della quota di malattia che è ancora presente, basandosi sul principio dell’elevata chemio e radio-sensibilità delle neoplasie ematologiche. I principali schemi di condizionamento usati nel trapianto autologo di CSE sono i seguenti (per convenzione il giorno dell’infusione è indicato come giorno 0):

    • BU-CY2 (BUSULFANO dal giorno -7 al giorno -4, CICLOFOSFAMIDE giorni -3 e -2);
    • BEAM (CARMUSTINA giorno -7, CITARABINA e ETOPOSIDE dal giorno -6 al giorno -3, MELFALAN giorno -2);
    • BEAC (CARMUSTINA giorno -6, CITARABINA, CICLOFOSFAMIDE e ETOPOSIDE dal giorno -5 al giorno -2);
    • MEL200 (MELFALAN giorno -2);
    • CY-TBI (CICLOFOSFAMIDE giorni -6 e -5, TOTAL BODY IRRADATION dal giorno -3 al giorno -1);
    • BU-MEL (BUSULFANO dal giorno -5 al giorno -2, MELFALAN al giorno -1);
    • MITO-MEL (MITOXANTRONE giorno -5, MELFALAN giorno -2).
  • Reinfusione di CSE

    Al termine della terapia di condizionamento, dopo un tempo sufficiente per eliminare dal circolo ematico i metaboliti dei farmaci somministrati, le sacche di CSE devono essere scongelate e reinfuse al paziente attraverso un catetere venoso centrale o, in alternativa, da una vena periferica di grosso calibro.
    Generalmente, il processo avviene in prossimità della stanza di degenza del paziente, immergendo la sacca in un bagno termostatico in cui l’acqua distillata è mantenuta a 37°C.
    La sacca viene mantenuta nel bagno termostatico fino alla scomparsa di tutti i cristalli di ghiaccio. La reinfusione delle CSE dovrebbe avvenire il più rapidamente possibile dopo lo scongelamento e, comunque, non oltre i 45 minuti dallo stesso.
    Le problematiche relative all’infusione sono correlate agli effetti tossici del DMSO contenuto nelle sacche. Nella maggior parte dei casi il paziente avvertirà delle vampate di calore, nausea, secchezza delle fauci e un “cattivo” sapore.
    In rari casi si possono avere degli effetti collaterali più importanti come brivido, febbre, insufficienza respiratoria, abbassamento dei valori pressori molto raramente fino allo shock.

  • Attecchimento

    La somministrazione della chemio e/o radioterapia di condizionamento comporta la cosiddetta “fase di aplasia”, cioè determina una drastica riduzione delle difese immunitarie del paziente (abbassamento del valore dei globuli bianchi, delle piastrine e dell’emoglobina), che lo espone ad un elevato rischio di infezioni e di emorragie anche fatali. L’aplasia midollare termina quando le CSE infuse, in grado da sole di trovare la strada per colonizzare le cavità midollari vuote, cominciano a proliferare, maturano e si differenziano in globuli bianchi, piastrine e globuli rossi.

    La durata della fase di aplasia midollare è variabile e dipende dall’intensità del condizionamento, dal numero di CSE infuse e dallo stato della malattia al trapianto. Alla fase di aplasia segue il cosidetto “attecchimento”, cioè la fase di recupero ematologico con salita dei valori dei globuli bianchi e delle piastrine, che si verifica generalmente dopo 10-15 giorni dal trapianto.

    Si definisce attecchimento in neutrofili e/o in piastrine il raggiungimento di valori di granulociti neutrofili superiori a 500/mmc, e/o di piastrine superiori a 20.000/mmc per almeno tre giorni consecutivi. Fino a quando l’attecchimento non è completo, però, il paziente è a rischio di infezioni ed emorragie e quindi necessita di un controllo particolarmente attento. Dopo la dimissione la ripresa midollare e periferica continua e sono generalmente necessari 6 mesi o più per avere una completa ricostituzione immunitaria.

  • Tossicità

    Il trapianto autologo è oggi una procedura relativamente sicura se eseguita in centri specializzati. Il miglioramento della terapia di supporto e della conoscenza dei principali effetti collaterali dei regimi di condizionamento, ha permesso negli ultimi anni di ridurre notevolmente le complicanze e la mortalità legata alla procedura (nota come Transplant Related Mortality, TRM). Tuttavia, il trapianto autologo di CSE rimane gravato da una certa tossicità e una mortalità (TRM), legata principalmente alle possibili complicanze infettive, che attualmente, almeno in centri che effettuino questa procedura in maniera routinaria, si verifica in  una percentuale non superiore al 2-3%.

    Le più comuni complicanze in corso di trapianto autologo sono:

    • Mucosite del cavo orale e del tratto gastroenterico;
    • Infezioni batteriche;
    • Riattivazioni virali (es. Cytomegalovirus);
    • Cistite emorragica;
    • Tossicità epatica e malattia veno-occlusiva;
    • Tossicità polmonare con distress respiratorio;
    • Insufficienza multi organo.
  • Indicazioni

    Le principali indicazioni per il trapianto autologo di CSE sono le patologie neoplastiche ematologiche ed i tumori solidi, purché siano radio-chemiosensibili. La maggior parte dei trapianti autologhi (90%) viene eseguita per le emopatie maligne, il restante per tumori solidi. L’età limite fino a cui è possibile venire sottoposti a tale procedura è cambiata con il miglioramento delle terapie di supporto e la minore tossicità dei farmaci usati durante le varie fasi della patologia. Se negli anni ’80 si riteneva non etico autotrapiantare oltre i 50 anni, oggi un paziente di 70 anni in condizioni cliniche buone può essere avviato a tale procedura senza un incremento significativo della tossicità e del rischio di morte. Tuttavia, al fine di limitare al massimo la tossicità e di effettuare il trapianto in regime di sicurezza, è necessario studiare molto attentamente il paziente prima del trapianto mediante lo “screening pre-trapianto”, con lo scopo di valutare bene che non vi siano delle condizioni cliniche tali da controindicare l’esecuzione del trapianto stesso.

    Le principali patologie in cui è indicato il trapianto autologo di CSE sono le seguenti:

    • Mieloma Multiplo e altre discrasie plasmacelluari;
    • Linfoma Non-Hodgkin;
    • Linfoma di Hodgkin;
    • Leucemia Mieloide Acuta;
    • Leucemia Linfoblastica Acuta (più raramente);
    • Tumori solidi chemio-sensibili (es. osteosarcoma, seminoma, sarcoma di Ewing, neoplasie mammaria ad elevata frazione di crescita, tumori a cellule germinali);
    • Malattie autoimmuni (LES, sclerosi sistemica progressiva, artrite reumatoide);
    • Malattie neurologiche (Sclerosi Multipla);
    • Malattie infiammatorie intestinali (es. Malattia di Crohn).
  • Indicazioni al trapianto autologo di CSE in pediatria

    Le indicazioni del Ministero della Salute (www.salute.gov.it) al trapianto autologo di CSE nei bambini sono le seguenti:

    • Leucemia mieloide acuta in prima o seconda remissione dopo purificazione midollare;
    • Leucemia linfoblastica acuta in seconda remissione dopo recidiva extramidollare isolata;
    • Linfomi maligni recidivati;
    • Neuroblastoma metastatico alla diagnosi;
    • Rabdomiosarcoma metastatico alla diagnosi;
    • Sarcoma di Ewing metastatico alla diagnosi;
    • Selezionati tipi di malattie autoimmuni refrattarie ai trattamenti convenzionali e quindi a prognosi infausta.
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Il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (CSE)

Foto trapianto allogenico

 

  • introduzione

    Il trapianto allogenico di CSE consiste nella reinfusione di cellule staminali ematopoietiche (CSE) di un donatore (il soggetto sano) in un ricevente (il soggetto malato) dopo che il ricevente è stato “condizionato” cioè preparato con la somministrazione di chemioterapia e/o radioterapia ad alta intensità, per questo detta “sovra-massimale”  e denominata di “terapia di condizionamento”. I primi tentativi di trapianto di CSE sono stati effettuati tra gli anni ’50 e ’60 subito dopo la scoperta del sistema maggiore di istocompatibilità (Major Histocompatibility Complex – Human Leukocyte Antigen, MHC-HLA) ed il primo trapianto, effettuato con successo secondo i criteri di compatibilità tessutale donatore/ricevente, è stato pubblicato nel 1968. Solo nel 1975, sono stati pubblicati dal gruppo americano di Seattle (Thomas)  i risultati ottenuti nei primi 110 pazienti trapiantati con CSE da sangue midollare, fornendo le basi per l’applicazione clinica del trapianto di CSE su larga scala. Questa procedura è oggi largamente impiegata nel trattamento di molte patologie ematologiche, sia neoplastiche che non neoplastiche, e rappresenta una valida opzione terapeutica anche per alcune patologie dismetaboliche congenite e gravi deficit immunitari. Contrariamente a quanto accade per il trapianto autologo di CSE, il razionale del trapianto allogenico non si basa solo sulla capacità della chemioterapia e/o radioterapia di condizionamento di eradicare la malattia, ma anche sull’effetto immunologico del trapianto stesso, cioè sulla capacità dei linfotici T del donatore di eliminare, con un meccanismo noto come “Graft Versus Leukemia” (GVL), le cellule neoplastiche del ricevente eventualmente ancora presenti nel ricevente nonostante la terapia di condizionamento.

  • Le CSE CD34-positive

    Le CSE, note anche con il nome di cellule CD34-positive per la presenza sulla loro superficie di questa molecola distintiva, sono cellule contenute nel midollo osseo ematopoietico e, in quantità nettamente minori anche nel sangue venoso periferico. Queste cellule sono in grado di dividersi e dare origine a due cellule figlie, una che va a ricostituire il patrimonio della CSE, e l’altra, che attraverso ulteriori divisioni, darà origine alle cellule del sangue venoso periferico, cioè i globuli bianchi, i globuli rossi e le piastrine (differenziamento). Potenzialmente, inoltre, le CSE sono in grado di dare origine a molte altre cellule del fegato, del polmone, dell’osso, del cervello e persino dei muscoli.
    
Le caratteristiche fondamentali delle CSE, che ne rendono possibile l’uso clinico nel trapianto, sono rappresentate da:

    • capacità di automantenimento;
    • differenziazione in precursori dei globuli bianchi, dei globuli rossi e delle piastrine;
    • capacità dopo essere state infuse per via endovenosa, di raggiungere la sede midollare e di insediarsi nel microambiente (“homing”);
    • capacità di restare vitali dopo processi di manipolazione come la criopreservazione e lo scongelamento.
  • Compatibilità e sistema HLA

    Individuare un donatore di CSE idoneo per poter procedere al trapianto significa tipizzare sia donatore che ricevente, ovvero verificare, con tecniche di biologia molecolare in alta risoluzione, che le cellule dell’uno e dell’altro siano HLA compatibili, ovvero presentino gli stessi antigeni di istocompatibilità. Di conseguenza, è un pre-requisito di fondamentale importanza per il successo del trapianto allogenico che sia il ricevente che il donatore abbiano un sistema HLA il più possibile simile, in modo da limitare il rischio della condizione nota come Graft Versus Host Disease (GVHD, Malattia del Trapianto contro l’Ospite), cioè quella condizione in cui linfociti del donatore colpiscono i tessuti del ricevente, non riconoscendoli come “propri”.
    I geni del sistema HLA hanno la caratteristica di essere estremamente variabili da individuo ad individuo; per tale motivo, la variabilità genetica è molto elevata al di fuori dell’ambito familiare mentre nell’ambito familiare è più ristretta ed ogni fratello ha una probabilità del 25% di essere HLA compatibile col paziente.
    Tuttavia, per dare la possibilità di trovare un donatore compatibile anche a quei pazienti che non dispongono di un donatore HLA-compatibile all’interno del nucleo familiare, sono stati creati i Registri Internazionali di Donatori Volontari di CSE o i Network di Banche di Sangue di Cordone Ombelicale (SCO).

  • Tipologia di trapianto allogenico

    Parliamo di:

    1. Trapianto singenico quando il donatore è rappresentato da un gemello identico omozigote.
    2. Trapianto allogenico di CSE da donatore familiare compatibile quando il donatore HLA-compatibile viene trovato all’interno del nucleo familiare del paziente (probabilità di circa il 25-30%).
    3. Trapianto allogenico di CSE da donatore volontario quando il donatore è un volontario iscritto nei Registri Internazionali di Donatori di CSE. Il tempo mediano per l’identificazione di un donatore volontario HLA compatibile può variare  da 1 a 16 mesi.
    4. Trapianto allogenico di CSE da sangue di cordone ombelicale (SCO) quando la fonte di CSE è costituita dal SCO prelevato al momento del parto da donatrici sane e accuratamente selezionate e conservato in Banche di SCO. Il tempo mediano per l’identificazione è di sole 3 settimane.
    5. Trapianto allogenico di CSE da familiare non compatibile (aploidentico) quando il donatore condivide con il paziente almeno un aplotipo del sistema HLA, condizione che è naturalmente riscontrabile nei genitori e figli del paziente. Il tempo mediano per la sua identificazione corrisponde ai tempi dello studio dell’HLA, cui seguono circa 10-15 giorni per la preparazione alla donazione. La scelta di questo tipo di trapianto è spesso dettata dall’urgenza clinica dello stesso.
  • Fonti e metodiche di raccolta delle CSE

    Attualmente sono 3 le fonti di CSE disponibili:

    1. midollo osseo ematopoietico
    2. sangue venoso periferico
    3. sangue cordonale.

    RACCOLTA DELLE CSE DAL MIDOLLO OSSEO
    Le CSE contenute nel midollo osseo vengono prelevate in anestesia generale o spinale attraverso ago-aspirati multipli di sangue midollare dalle creste iliache posteriori (espianto di midollo osseo). Per un paziente di 75 Kg vengono prelevati circa 1,5 L di sangue midollare. Il sangue midollare prelevato viene filtrato per eliminare grasso e spicole ossee e, nella stessa giornata del prelievo, infuso al paziente per via endovenosa. La mediana di cellule nucleate totali e di cellule CD34-positive, prelevate con la procedura di espianto midollare e in grado di garantire un attecchimento emopoietico duraturo,  sono rispettivamente considerate > 2 x 108/kg e > 2 x 106/kg di peso del ricevente. Rispetto al prelievo da sangue periferico, il trapianto di midollo osseo contiene una più ridotta quantità di linfociti T. Le complicanze maggiori  legate alla procedura di espianto sono rappresentate dal rischio anestesiologico. Complicanze minori sono raramente le microfratture del bacino, più spesso dolore ed ematomi della parte interessata.

    RACCOLTA DELLE CSE DAL SANGUE VENOSO PERIFERICO
    Sebbene in condizioni basali la quantità di CSE CD34-positive circolanti nel sangue periferico sia molto bassa, a seguito di somministrazione del fattore di crescita G-CSF (Granulocyte-Colony Stimulating Factor) si ottiene una elevata mobilizzazione di cellule CD34-positive dal midollo osseo al sangue periferico. Al donatore viene somministrato G-CSF per 3-5 giorni e successivamente viene sottoposto a procedura di staminoaferesi. Tale procedura si avvale dell’utilizzo di una macchina, che, in circolazione extra-corporea, è in grado di separare le cellule mononucleate dalla restante parte corpuscolata del sangue, i globuli rossi e le piastrine, che vengono, quindi, restituiti al donatore. La dose raccolta è variabile tra 2 e 8 cellule CD34+x 106/kg di peso corporeo del ricevente. L’infusione al paziente viene eseguita entro 24 ore. Nella raccolte delle CSE da sangue periferico, la dose di cellule CD34-positive raccolte è molto più elevata rispetto a quella che si raccoglie dal midollo osseo ematopoietico, così come è maggiore la concentrazione di linfociti T. In pratica, questo si traduce in un attecchimento più rapido e in un maggior rischio di GVHD, soprattutto cronica. Le complicanze più frequenti sono dovute alla somministrazione del fattore di crescita granulocitario nei giorni precedenti l’aferesi (febbricola, mialgia, cefalea) o agli squilibri elettrolitici che si possono determinare durante la procedura stessa con l’insorgenza di parestesie.

    RACCOLTA DELLE CSE DAL SANGUE DI CORDONE OMBELICALE (SCO)
    Il SCO è caratterizzato da un contenuto di cellule staminali emopoietiche simile a quello del midollo osseo adulto, ma con una maggiore proporzione di cellule progenitrici immature dotate di maggiore potenziale proliferativo. Il SCO, inoltre, sembra contenere una popolazione linfocitaria più primitiva ed immatura rispetto al sangue periferico, a cui funzionalmente corrisponde una ridotta reattività immunologica dei linfociti T. Il SCO è facile da raccogliere e da criopreservare, senza alcun rischio per la madre e per il neonato; esso viene raccolto al momento del parto incannulando la vena ombelicale e le CSE presenti vengono criopreservate nelle “banche del cordone”. Un limite per l’utilizzo clinico su larga scala del SCO consiste nella bassa dose di cellule nucleate totali e di CSE CD34-positive contenute nelle singole unità, dovute allo scarso volume delle stesse: ciò comporta una ripresa emopoietica più tardiva e un maggior rischio di mancato attecchimento rispetto alle altre fonti di CSE . Tale caratteristica ha inizialmente limitato l’uso del trapianto SCO ai soli pazienti pediatrici. Attualmente, tuttavia, l’applicazione del trapianto SCO nei pazienti adulti ha superato per numerosità quella della popolazione  pediatrica.

  • Regimi di condizionamento

    Il regime di condizionamento pre-trapianto consiste nella somministrazione, in un periodo di tempo variabile tra 2 e 9 giorni, di alte dosi di chemio +/- radioterapia prima delle infusione delle CSE al fine di raggiungere due obiettivi principali:

    1. L’eradicazione della malattia di base sfruttando l’effetto mieloablativo di dosi sovra-massimali di chemio-radioterapia, determinando la  totale  scomparsa  del  compartimento di cellule staminali totipotenti malate del paziente e di “creare spazio” alle cellule progenitrici del donatore sano;
    2. Il superamento della barriera immunologica dell’ospite mediante l’uso di agenti chemioterapici con potente effetto immunosoppressore;

    I regimi di condizionamento attualmente utilizzati per il trapianto allogenico si basano sull’uso di farmaci con azione mieloablastiva (Busulfano, Ciclofosfamide, Melfalan), oppure sull’uso della radioterapia (“Total Body Irradiation”, TBI). Questi regimi di chemioterapia sono molto intensivi e, per tale motivo, è necessaria una rigorosa selezione del paziente da sottoporre a trapianto.

    Vengono oggi considerati eleggibili per un trapianto allogenico con condizionamento “mieloablativo” i pazienti di età inferiore a 55-60 anni, in buone condizioni generali, con funzionalità cardiaca, renale e respiratoria conservata, che non presentino altre gravi patologie al momento del trapianto. A partire dalla seconda metà degli anni ‘90, per poter estendere la procedura trapiantologica allogenica anche a pazienti non in grado di tollerare  regimi di condizionamento “mieloablativi”, è iniziata la sperimentazione clinica di regimi di condizionamento ad intensità ridotta (Reduced Intensity Conditioning; RIC), basati sull’impiego di agenti immunosoppressivi e mielotossici a dosi non mieloablative, con conseguente minore tossicità globale. I condizionamenti RIC basano il loro potere terapeutico non tanto sull’azione citoriduttiva della chemio-radioterapia, quanto sull’effetto allogenico, immunoterapeutico del trapianto stesso, quindi sull’effetto “Graft-versus Leukemia” (GVL). Il trapianto allogenico con condizionamento RIC è ben tollerato e risulta ormai eseguibile anche in pazienti di età avanzata, fino anche a più di 70 anni, o nei pazienti più giovani  utilizzabile in quelli  con performance status non adeguato.

  • La fase di ricostituzione emopoietica

    L’infusione delle CSE viene effettuato di norma dopo 24-48 ore dal termine della chemioterapia di condizionamento, generalmente mediante un catetere venoso centrale. La tossicità extraematologica dei regimi di condizionamento si verifica entro i primi 15 giorni e può coinvolgere qualsiasi organo, cuore, rene, polmone, fegato e principalmente sistema gastroenterico con mucosite. Il condizionamento comporta la cosiddetta “fase di aplasia”, con abbassamento del valore dei globuli bianchi, delle piastrine e dell’emoglobina e conseguente esposizione ad un elevato rischio di infezioni e di emorragie che possono essere anche fatali. L’aplasia midollare termina quando le CSE infuse proliferando maturano e si differenziano in globuli bianchi, piastrine e globuli rossi.

    La durata della fase di aplasia midollare è variabile e dipende dall’intensità del condizionamento, dal numero di CSE infuse e dalla fonte di CSE e dal tipo di donatore. Alla fase di aplasia segue il cosidetto “attecchimento”, cioè la fase di recupero ematologico con salita dei valori dei globuli bianchi e delle piastrine, che si verifica generalmente dopo 12-24 giorni dal giorno del trapianto.

    Si definisce attecchimento in neutrofili e/o in piastrine il raggiungimento di valori di granulociti neutrofili superiori a 500/mmc, e di piastrine superiori a 20.000/mmc per almeno tre giorni consecutivi. Fino a quando l’attecchimento non è completo, il paziente è a rischio di infezioni ed emorragie e quindi necessita di un controllo particolarmente accurato. Dopo la dimissione,  il paziente verrà seguito in regime ambulatoriale e di day-hospital con cadenza settimanale fino al 100° giorno, periodo di stretta sorveglianza, quindi, in assenza di complicazioni, i controlli divengono bisettimanali fino al 180° giorno e successivamente nel paziente senza complicanze si potranno effettuare mensilmente fino al termine del primo anno post-trapianto.

  • La Graft-versus-Host Disease (GVHD)

    La GVHD è la complicanza specifica che si osserva nei pazienti sottoposti a trapianto allogenico di CSE ed è espressione di una complessa reazione immunologica delle cellule immunocompetenti del donatore nei confronti dei tessuti ed organi del ricevente. Si distingue la GVHD acuta (che insorge entro i primi 100 giorni dal trapianto) e la GVHD cronica che può manifestarsi più tardivamente.  

    GVHD ACUTA
    Le manifestazioni cliniche della GVHD acuta sono caratterizzate principalmente dall’interessamento della cute, dell’intestino e del fegato. Il coinvolgimento della cute si manifesta come tipico eritema morbilliforme maculo-papuloso, che dalla tipica localizzazione al palmo delle mani e alla pianta dei piedi, si può estendere al volto, al tronco, alle radici e, successivamente, alla superficie degli arti.. La GVHD intestinale è caratterizzata dalla presenza di diarrea, malassorbimento e perdita imponente di proteine. Al fine di ridurre il rischio di GVHD acuta, vengono somministrati potenti immunosoppressori quali ciclosporina e methotrexate, prima, durante e dopo il trapianto. Altri farmaci usati sono il tacrolimus, il micofenolato, gli anticorpi policlonali diretti contro i linfociti T (Anti-Thymocyte Globulin, ATG) e gli anticorpi monoclonali (anti-CD25, Basiliximab; anti-CD52 Alemtuzumab). Un'altra tecnica usata per ridurre il rischio di GVHD nel trapianto aploidentico è la deplezione T-cellulare, effettuata con tecniche di manipolazione ex-vivo, che espone tuttavia ad una maggior rischio di infezioni e ad una minore efficacia della GVL.Una volta innescata, la GVHD deve essere tempestivamente trattata con steroidi ad elevato dosaggio o, nel caso di mancata risposta, con trattamenti di seconda linea quali Infliximab, fotoaferesi extracorporea e, più recentemente, con la somministrazione di cellule mesenchimali.

    GVHD CRONICA
    La GVHD cronica, che insorge dopo i 100 giorni dal trapianto è una complessa sindrome a patogenesi immunologica, che si osserva con un’incidenza estremamente variabile dal 5% al 70% dei pazienti sottoposti a trapianto allogenico a seconda di numerosi fattori concomitanti, molti dei quali condivisi con quelli correlati alla GVHD acuta, la cui insorgenza è di per sé fattore favorente la GVHD cronica. E’ ormai ampiamente riconosciuta l’aumentata incidenza di GVHD cronica per l’impiego di CSE prelevate dal sangue periferico. Le manifestazioni della GVHD cronica possono aversi a carico di molti organi e tessuti: la cute e gli annessi cutanei, la mucosa del cavo orale e genitale, la congiuntiva, il tratto gastroenterico.  I tessuti sono sovvertiti con un’ impronta fibrotica o atrofica, che ricorda altre malattie infiammatorie croniche. Il trattamento della GVHD cronica è basato sulla somministrazione di steroidi, in associazione o meno alla ciclosporina. Il trattamento di seconda linea della GVHD cronica resistente agli steroidi prevede, nell’ordine di più diffuso impiego, la fotoforesi extracorporea, l’anticorpo monoclonale anti CD20+ (rituximab), il micofenolato, gli inibitori della tirosin-kinasi (imatinib), la pentostatina.

  • La Graft-versus Leukemia (GVL)

    Nell’ambito del trapianto allogenico e delle manifestazioni di GVHD, si osserva una reazione di natura immunologica detta Graft-versus-Leukemia (GVL) o Graft-versus-Tumor (GVT), in quanto sostenuta dalle cellule immunocompetenti del donatore nei confronti delle cellule leucemiche o tumorali residue del ricevente. Questa reazione è particolarmente importante, in quanto consente di superare il limite della resistenza alla chemioterapia e alla radioterapia delle cellule leucemiche o tumorali, che diventano in questo caso cellule bersaglio di reazione immunomediata. Il sistema immune del donatore, in altri termini, contribuisce alle possibilità di guarigione del paziente esercitando una sorveglianza immunologica nel tempo nei confronti della malattia tumorale.

  • Le complicanze del Trapianto Allogenico

    Il trapianto allogenico può essere associato a diverse complicanze secondarie alla stessa procedura, la cui insorgenza dipende da diversi fattori riferibili sia a caratteristiche del paziente (età,  diagnosi, stato della malattia al momento del trapianto, presenza di comorbidità), sia a caratteristiche della combinazione donatore/ricevente (es. tipo di compatibilità), sia a caratteristiche specifiche della procedura trapiantologica (es. intensità del regime di condizionamento pre-trapianto, fonte di CSE  impiegate, eventuale manipolazione cellulare in vitro prima dell’infusione). Le complicanze legate al trapianto allogenico possono essere fatali e possono indurre quella che viene comunemente definita con il termine tecnico Transplant-Related Mortality (TRM) o mortalità trapianto correlata, non determinata quindi dalla eventuale recidiva della malattia.
    Qui di seguito riportiamo un breve cenno a tutte le possibili complicanze del trapianto allegenico (escludendo la GVHD, già discussa sopra).

    LE INFEZIONI BATTERICHE, FUNGINE E VIRALI
    Le complicanze infettive sono una delle principali cause di morbidità e mortalità nel paziente trapiantato. In rapporto ai tempi del post-trapianto indicando  0 il giorno dell’infusione, la complicanza infettiva può insorgere in fase  precoce o pre-attecchimento (dal giorno 0 a +30),  in fase intermedia post-attecchimento (dal giorno +30 a + 100) e in fase  tardiva (>100 giorni).
    Fattori di rischio delle infezioni della fase precoce o pre-attecchimento sono la neutropenia, la linfopenia, la compromissione delle barriere anatomiche e la ridotta funzionalità dei linfociti B e T.
    Fattori di rischio delle infezioni della fase intermedia o post-attecchimento sono la persistente immunodepressione, l’insorgenza della GVHD acuta e la terapia immunosoppressiva per il suo controllo.
    Fattori di rischio delle infezioni della fase tardiva sono la lenta e prolungata ricostituzione immunologica e, in particolare, la presenza di GVHD cronica con le relative eventuali terapie per essa utilizzate.

    Infezioni della fase precoce (dal giorno 0 a +30)
    Batteri
    Le infezioni batteriche sono la principale causa del primo episodio febbrile che compare nella fase di neutropenia post-trapianto e sono rappresentate nella maggior parte dei casi da sepsi batteriemiche da germi Gram positivi (stafilococchi, streptococchi) o Gram negativi (E. coli, P. aeruginosa, Klebsiella spp).

    Funghi
    Le infezioni fungine invasive (IFI) hanno un picco di incidenza bimodale: nella fase precoce e in seguito nella fase tardiva. Sono rappresentate da polmoniti e sinusiti da funghi filamentosi o muffe come Aspergillus ssp o Candida spp, che con maggiore frequenza viene isolato. Queste infezioni insorgono o per riattivazione di funghi di cui il paziente è portatore o per inalazione di spore fungine presenti nell’ambiente, da cui l’indicazione ad assistere il paziente trapiantato in stanza protetta con flusso d’aria ad alta filtrazione microbica. Le IFI presentano un’incidenza variabile dal 8% al 15% secondo le diverse casistiche e sono correlate con una mortalità elevata.

    Virus
    Le infezioni virali della fase precoce sono piuttosto rare e sono principalmente rappresentate da orofaringite, epatite, encefalite, mielosoppressione e cistite, variamente indotte da Herpes simplex virus, Herpes virus 6 (HHV6) e BK virus.

    Agenti patogeni ed infezioni della fase intermedia (dal giorno +30 a +100)
    Citomegalovirus (CMV)
    Nelle condizioni di profonda immunodepressione, quale si realizza nel post-trapianto, il CMV può riattivarsi. Tale rischio di riattivazione è significativamente più elevato nei pazienti sierologicamente CMV positivi trapiantati da donatori CMV negativi.

    Funghi
    Le infezioni fungine sono anche in questa fase rappresentate in maggior parte da polmoniti e sinusiti, in genere da Aspergillus spp o da Candida spp.

    Agenti patogeni ed infezioni della fase tardiva (>100 giorni)
    Le infezioni in questa fase sono correlate allo stato di grave immunodepressione associato all’insorgenza di una GVHD cronica estensiva e alla terapia immunosoppressiva ad essa correlata. In questa fase si possono verificare sia infezioni batteriche (germi capsulati come Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae, Nocardia, Legionella, Listeria), che fungine (Criptococcus, Pneumocystis jiroveci, Toxoplasma gondii), che virali (virus Varicella-Zoster).

    LA MALATTIA VENO-OCCLUSIVA (VOD)
    La VOD è una complicanza ad insorgenza precoce che compare entro i primi 20-30 giorni post-trapianto e viene favorita da cicli di condizionamento a base di busulfano per os, ciclofosfamide e da epatopatie. L’incidenza è molto diversa a seconda dei fattori di rischio presenti e varia dal 3% al 54%.
    Il quadro clinico è caratterizzato da ittero a bilirubina diretta, dolore nei quadranti superiori destri dell’addome, aumento ponderale dovuto a versamento ascitico e ritenzione idrica. E’ fondamentale che la diagnosi, fondata essenzialmente sui segni clinici  e supportata da indagini strumentali quali l’ecodoppler del circolo epato-portale, sia posta precocemente per iniziare il trattamento che si basa sull’impiego di terapia diuretica, trasfusione di plasma e prociclide .

    MICROANGIOPATIA TROMBOTICA
    La microangiopatia trombotica è una temibile complicanza che in letteratura presenta una incidenza estremamente variabile a seconda delle diverse casistiche (dall’1 al 70%).
    L’insorgenza della microangiopatia trombotica è caratterizzata da un danno endoteliale diffuso che provoca la formazione di trombi a livello del microcircolo con fenomeni ischemici principalmente a carico del rene e del sistema nervoso centrale, simile alla porpora trombotica trombocitopenia classica o sindrome di Moschowitz.
    Il quadro  clinico consiste in anemia emolitica su base meccanica con aumento degli schistociti circolanti, ittero, piastrinopenia, danno renale e sintomi neurologici.
    La diagnosi precoce è importante per poter iniziare rapidamente un trattamento, prima che lo stabilirsi di un danno d’organo renda la prognosi più sfavorevole. La terapia si basa sulla sospensione della terapia con eventuali inibitori della calcineurina (possibili agenti causali) ed infusione di plasma, mentre controverso è l’uso del plasma exchange.

    CISTITE EMORRAGICA
    La cistite emorragica deve essere considerata una complicanza maggiore del post-trapianto e può essere determinata da 2 possibili effetti causali:

    1. effetto tossico dei farmaci impiegati nel ciclo di condizionamento sulle cellule della vescica;
    2. infezioni provocate da virus che interessano il tratto urinario.

    La cistite emorragica da farmaci appare precocemente dopo trapianto ed il farmaco maggiormente implicato nella patogenesi è la ciclofosfamide e più raramente altri farmaci (es. ifosfamide).
    La forma associata ad infezioni virali compare più tardivamente, in genere dopo il giorno +30 dal trapianto ed appare dovuta a BK poliomavirus e adenovirus,
    La profilassi della cistite emorragica è basata su iperidratazione, lavaggio endovescicale continuo e somministrazione di MESNA durante il regime di condizionamento che includa la somministrazione di ciclofosfamide ad alte dosi. Il trattamento comprende la terapia di supporto basata sulle trasfusioni di emazie concentrate e piastrine, iperidratazione e irrigazione vescicale e, nelle forme ad eziologia virale, l’impiego di antivirali quali il cidofovir. Del tutto recentemente sono stati ottenuti risultati particolarmente promettenti con l’applicazione diretta di colla di fibrina in cistoscopia sulla mucosa endovescicale emorragica, specie nelle forme non rispondenti ai trattamenti convenzionali.

    Altre possibili complicanze tardive del trapianto allogenico sono:
    Endocrinopatie, malattie linfoproliferative EBV-correlate e seconde neoplasie.

  • Indicazioni del trapianto allogenico di CSE

    Leucemia Mieloide Acuta (LMA)
    Il trapianto allogenico rappresenta la terapia di scelta per le categorie di pazienti con LAM in 1° remissione a rischio sfavorevole e con MMR ancora positiva dopo terapia di consolidamento, non è attualmente indicato per i pazienti a rischio favorevole o per quelli a rischio intermedio, ma con MMR negativa dopo consolidamento.

    Leucemia Linfoide Acuta (LLA)
    La presenza di fattori prognostici sfavorevoli quali la presenza del cromosoma Philadelphia t(9:22), un numero di globuli bianchi/mmc > di 30.000 (se a cellule B) o > di 100.000 (se a cellule T) e il cariotipo complesso, permettono di identificare i pazienti ad alto rischio. Questo aspetto è rilevante soprattutto per i pazienti in 1a RC, nei quali l’indicazione al trapianto allogenico non è ancora ben definita. Lo studio della MMR post consolidamento fornisce ulteriore, importante indicazione per discriminare i pazienti che (MMR-) possono beneficiarsi della sola chemioterapia da coloro per i quali (MMR+) il trapianto allogenico costituisce terapia elettiva.

    Sindromi Mielodisplastiche (SMD)
    Il trapianto allogenico è indicato soprattutto per i pazienti che appartengono ai gruppi intermedio II e alto rischio. Nell’ultimo anno, in ambito EBMT, sono stati registrati oltre 1700 trapianti allogenici eseguiti per tale patologia, essendo tale incremento dovuto sia all’aumento delle procedure nei pazienti con età superiore ai 50 anni, sia all’estensione sempre maggiore del trapianto da donatore non correlato.

    Leucemia Mieloide Cronica (LMC)
    L’introduzione degli inibitori della Tirosin-Kinasi (TKI) ha nettamente migliorato la prognosi dei pazienti affetti da LMC Ph+ e drasticamente ridotto l’indicazione al trapianto allogenico, riservato ai soli pazienti non rispondenti ai TKI, rcecidivanti o in progressione di malattia.

    Mielofibrosi Idiopatica
    Il trapianto allogenico rappresenta attualmente l’unico trattamento curativo per la mielofibrosi, ma l’eterogeneità in termini di manifestazioni cliniche, gravità dei sintomi e prognosi richiedono un’attenta selezione.

    Leucemia Linfatica Cronica (LLC)
    Il trapianto allogenico rappresenta una valida alternativa per i pazienti affetti da LLC con caratteristiche a cattiva prognosi. In tale patologia l’effetto GVL esercitato dai linfociti citotossici del donatore sembra essere particolarmente evidente. Data l’età in genere avanzata dei pazienti, risulta frequente l’impiego di condizionamenti ad intensità ridotta.

    Linfomi non Hodgkin e Linfomi di Hodgkin
    Il trapianto autologo rappresenta il trattamento di scelta per la cura di pazienti con patologie linfomatose di particolare aggressività. L’alternativa del trapianto allogenico, al momento, è limitata ai casi di malattie recidivanti dopo autotrapianto o ad alto rischio di recidivare.

    Mieloma Multiplo
    L’introduzione di nuovi farmaci per la terapia dei pazienti con mieloma e l’impiego del trapianto autologo costituiscono oggi lo standard di trattamento in tale patologia. Il trapianto allogenico, per l’elevato rischio di mortalità ad esso correlato, è limitato alle condizioni di malattia recidivante dopo autotrapianto o con caratteristiche biologiche di cattiva prognosi. Tuttavia, esso rimane la sola procedura capace di consentire la guarigione.

    Aplasia Midollare Grave
    Il trapianto allogenico da donatore familiare HLA identico rappresenta la prima scelta per pazienti giovani, con età < 30 anni o, in assenza di comorbidità, nei pazienti compresi tra 30 e 40 anni. Nei pazienti che non dispongono di un donatore familiare HLA identico e non rispondenti alla terapia immunosoppressiva, è indicato il trapianto da donatore internazionale non correlato.

    Emopatie congenite
    Il razionale del trapianto allogenico nelle emopatie congenite consiste nella sostituzione della cellula staminale ematopoietica patologica con cellule sane da donatore. Questo vale tanto nelle patologie con eritropoiesi inefficace, come la talassemia, quanto nelle patologie con produzione di emoglobina “difettosa”, come la drepanocitosi.

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Pratiche terapeutiche

Foto pratiche terapeutiche

 

  • la trasfusione di emoderivati

  • la chemioterapia

  • gli anticorpi monoclonali

  • il catetere venoso centrale

  • la radioterapia

  • le infezioni in ematologia

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Analisi ed esami speciali

Foto analisi ed esami speciali

 

Che cos'è un emocromo

L’esame emocromocitometrico rappresenta l’indagine indispensabile da effettuare per verificare la presenza di alterazioni primitive delle componenti del sangue, dovute a malattie dell’emopoiesi, o secondarie a malattie extra-emopoietiche. Per effettuarlo si preleva sangue venoso mediante puntura di una grossa vena, generalmente del braccio, direttamente immesso in una provetta contenente dell’anticoagulante e mantenuto a temperatura ambiente fino al momento dell’uso.
Con l’emocromo si possono determinare vari parametri, tra cui la concentrazione di emoglobina ed il livello delle diverse componenti corpuscolate del sangue periferico.
Oggi, nei moderni laboratori di analisi, si usano strumenti automatici che consentono l’esecuzione in serie di un numero notevole di esami in breve tempo, con la valutazione di una serie di indici che permettono al medico di stabilire se vi sono anomalie a carico delle componenti del sangue.
Tra le sigle e i parametri valutati con l’emocromo i più importanti sono:
Ht- ematocrito: esprime la valutazione della massa eritrocitaria in rapporto al volume di plasma.
Hb-concentrazione di emoglobina: esprime la quantità di emoglobina in grammi presenti in un litro di sangue. La lettura si effettua mediante apparecchi automatizzati, che sono in grado di determinare anche parametri quali MCHC (concentrazione emoglobinica corpuscolare media, espressa in gr/dl) e MCH (contenuto emoglobinico corpuscolare medio).
RBC o GR- red blood cells o globuli rossi: è il numero dei globuli rossi per litro di sangue. I globuli rossi contengono l’emoglobina, la proteina che trasporta ossigeno e anidride carbonica per lo scambio del metabolismo cellulare. Si formano nel midollo osseo.
MCV-volume corpuscolare medio: indica il volume medio dei globuli rossi.
WBC o GB-globuli bianchi: white blood cells o globuli bianchi e/o leucociti. E’ il numero dei globuli bianchi per litro di sangue. Si riconoscono diversi tipi:
  • neutrofili: difendono dalle infezioni batteriche.
  • eosinofili: difendono da infezioni parassitarie e aumentano in caso di allergia.
  • basofili: funzioni ancora non certe, contengono istamina.
  • monociti: intervengono nella difesa contro alcune infezioni batteriche come la tbc.
  • linfociti: si suddividono in linfociti B, T; i B sono deputati alla produzione di anticorpi, i T intervengono nelle infezioni di tipo virale e nel riconoscimento specifico di cellule estranee (anche nei trapianti).
Plts-piastrine: o trombociti, indica il numero di piastrine presenti nel campione esaminato. Queste sono fondamentali nel complesso processo della coagulazione.
Negli strumenti computerizzati, il conteggio è effettuato secondo lo strumento impiegato. In alcuni ad esempio viene sfruttato l’aumento di impedenza elettrica che le cellule, povere in conduzione di elettricità, generano nel passaggio attraverso una apertura in un campo elettrico; in altri invece vengono registrate le modificazioni di intensità luminosa di un raggio rifratto, mediante luce bianca o laser.
Mediante queste tecniche, con i più recenti apparecchi sono forniti anche altri parametri eritrocitari. Infatti l’RDW (ampiezza della distribuzione eritrocitaria) misura l’eterogeneità nel volume dei globuli rossi, misurando così l’anisocitosi.
Altri apparecchi danno anche una misurazione non solo numerica, ma anche semiquantitativa della micro- o macrocitosi, ovvero delle minori o maggiori dimensioni dei globuli rossi.
Sulle curve di distribuzione dell’emoglobina, si valuta la concentrazione interna di questa e si misura l’ipocromia (globuli rossi con zona centrale più pallida e quindi meno colorata) o l’ipercromia (globuli rossi ipercolorati). La poichilocitosi è invece la variazione del contorno del globulo rosso, come accade in alcune forme di anemie (ad es. le emazie a falce della drepanocitosi).
I nuovi apparecchi automatici inoltre misurano dei parametri anche per le piastrine, come il PDW (grado di anisocitosi o variazione di ampiezza piastrinica) e il MPV (volume piastrinico medio).
Nella diagnostica delle anemie è molto utile il conteggio dei reticolociti, cioè degli eritrociti giovani, che contengono nel loro interno residui di acido nucleico. Oltre che con i metodi tradizionali, quali le colorazioni con il blu di metilene o con il blu brillante di cresile, è possibile ora contarli con metodo automatico mediante l’uso di coloranti legati a fluorocromi, cioè a sostanze fluorescenti. E’ così possibile individuare e contare i reticolociti in valore percentuale, suddividendoli in tre popolazioni: a bassa, media ed alta fluorescenza.

Esame morfologico del sangue venoso periferico

E’ indispensabile per una corretta valutazione diagnostica in campo ematologico. Consente infatti di osservare eventuali anomalie dei globuli rossi, bianchi e delle piastrine, eventuali variazioni della formula leucocitaria con la presenza o meno di cellule immature.
Per l’esecuzione dello striscio può essere utilizzato sangue intero o contenente anticoagulante della provetta; la colorazione si effettua con la metodica di May-Grunwald-Giemsa nei paesi europei, mentre negli Stati Uniti si utilizza la colorazione di Wright.
L’esame microscopico si effettua inizialmente a piccolo ingrandimento per una valutazione globale del preparato, che ci indica la leggibilità e la distribuzione dei leucociti e delle piastrine. Poi con un maggiore ingrandimento è possibile individuare le modificazioni di forma e di dimensioni dei globuli rossi, la morfologia dei leucociti con la valutazione della formula leucocitaria e la eventuale presenza di cellule anomale. Inoltre è possibile valutare la presenza di piastrine, la morfologia di queste e la possibile presenza di aggregati.
 
Alcuni esempi di morfologia dei globuli rossi
Normalità: forma biconcava con contorni lisci e maggiormente colorati in periferia con alone centrale più chiaro.
Variazioni di forma e dimensioni: valutazione della anisocitosi e della poichilocitosi (vedi par.1). Riscontro di alcune forme caratteristiche quali i dacriociti (emazie a lacrima) come nel caso di focolai di emopoiesi extra-midollari (patognomonici della mielofibrosi); ellissociti ed ovalociti (emazie ovali) si possono riscontrare nelle anemie da carenza vitaminica, nella mielofibrosi ma soprattutto nell’ellissocitosi ed ovalocitosi ereditaria (patologie di membrana del globulo rosso).
Il termine macrocitosi indica un aumento del volume del globulo rosso come accade in condizioni di carenze vitaminiche, nell’anemia aplastica o nelle anemie diseritropoietiche. La microcitosi al contrario, indica una diminuzione del volume cellulare come nel caso dell’anemia da carenza di ferro nelle talassemie.
Inadeguata sintesi di emoglobina: ipocromasia quando i globuli rossi sono più pallidi per riduzione della sintesi dell’eme o della globina (ad es. anemie da carenza di ferro). Si ha invece ipercromasia quando i globuli rossi sono colorati di più per aumento del loro spessore come nel caso delle anemie da carenze vitaminiche o nel caso della sferocitosi ereditaria.
Danno periferico: il fenomeno della sferocitosi (forma sferica del globulo rosso con aumento dello spessore) si può avere in forme emolitiche come nel caso di un difetto genetico di membrana (sferocitosi ereditaria) o, quando la superficie del globulo rosso interagisce per la presenza di immunoglobuline sulla superficie (anemie emolitiche autoimmuni).
Schistocitosi è il fenomeno per cui si osservano frammenti di globuli rossi, come avviene nelle talassemie o nelle anemie carenziali, ma soprattutto in condizioni di stress meccanico (anemie emolitiche microangiopatiche) o nella porpora trombotica trombocitopenica (sindrome di Moschowitz).
Altre anomalie dei globuli rossi: cellule a bersaglio (quando è colorata anche una area centrale) come nel caso delle talassemie; drepanociti (emazie a falce) per l’alterazione della sintesi dell’emoglobina, assumono questa tipica forma a falce o semiluna; echinociti, quando sulla superficie sono presenti dei rilievi spinosi (come nel caso dell’insufficienza renale) o acantociti, con rilievi più grossolani come nel caso di un alterato metabolismo fosfolipidico. Gli stomatociti, quando la parte centrale è ridotta ad una sottile fessura, come nelle condizioni emolitiche ereditarie.
 
Morfologia piastrinica
Con l’esame dello striscio si possono valutare: il numero, le dimensioni, la morfologia ed il fenomeno degli aggregati piastrinici.
I megatrombociti si riscontrano in diverse patologie congenite o non, che riguardano sia le piastrine (sindrome di Bernard-Soulier, piastrinopenia autoimmune, sindrome di Moschowitz, etc.) che il sistema emopoietico (sindromi mielodisplastiche, sindromi mieloproliferative croniche, etc.).
Gli aggregati piastrinici possono essere espressione di un’alterazione legata all’anticoagulante presente nelle provette (EDTA), che causa una falsa riduzione del numero delle piastrine.
 
Alcuni cenni sulla morfologia dei leucociti
Con il piccolo ingrandimento del microscopio si inizia generalmente dando una stima del numero e della formula leucocitaria.
Si riscontrano poi le eventuali anomalie nucleari e/o citoplasmatiche e la presenza di cellule immature; un esempio di anomalia nucleare è per esempio l’ipersegmentazione del nucleo che si riscontra nei neutrofili nel caso di un’anemia da carenza vitaminica. Anomalie del citoplasma si riscontrano ad esempio nelle sindromi mielodisplastiche (degranulazione, presenza di granulazioni anomale) o nelle infezioni (ipergranulazione, vacuolizzazione).
La presenza di un monomorfismo è indicativo di un processo leucemico acuto, mentre invece uno sbilanciamento verso la linea mieloide con una leucocitosi può essere indice di un processo leucemico cronico o di una reazione leucemoide (leucocitosi di solito legata ad un processo infettivo, ad una neoplasia invasiva o ad iperemolisi acuta); uno sbilanciamento verso la linea linfatica, con aumento dei linfociti può essere espressione di una leucemia linfatica cronica o di un processo infettivo virale.

L'agoaspirato midollare e la biopsia ossea

L’esame del midollo osseo trova indicazione in tutte le condizioni in cui si sospetti una compromissione primitiva o secondaria dell’emopoiesi.
Nel midollo osseo sono contenuti i progenitori o precursori dei globuli rossi (eritroblasti), dei globuli bianchi (granuloblasti, differenti precursori che maturano con fasi maturative distinte a seconda del tipo), delle piastrine (megacariociti).
L’esame microscopico del midollo consente la valutazione morfologica, citochimica e fenotipica delle singole cellule ed è indispensabile per la classificazione di alcune condizioni ematologiche come le leucemie acute e le sindromi mielodisplastiche.

  • L’aspirato midollare consiste nel prelievo di sangue midollare. Per il prelievo si utilizza un ago corto, robusto ed affilato che possiede ad una estremità un fermo regolabile ed è attraversato da un mandrino. Le sedi utilizzate per il prelievo, che usualmente è eseguito dopo anestesia locale, sono:
    - cresta iliaca posteriore (parte posteriore del bacino) a qualsiasi età.
    - sterno (torace anteriore)
    - cresta iliaca anteriore (parte anteriore del bacino), nei bambini.
    L’aspirazione è breve, necessaria a prelevare una piccola quantità di sangue midollare; la manovra, anche se fastidiosa, non è generalmente molto dolorosa.
    Il materiale aspirato viene posto su dei vetrini e strisciato. Dopo la colorazione e la asciugatura, si può osservare al microscopio valutando la cellularità e ricercando a piccolo ingrandimento la presenza dei megacariociti e la loro funzionalità; la presenza di cluster (raggruppamenti) di cellule estranee al midollo e la presenza di monomorfismo cellulare.
    A grande ingrandimento si ricercano poi le eventuali anomalie morfologiche delle tre serie emopoietiche (eritroblasti, granuloblasti e megacariociti).

 

  • La biopsia ossea consiste nel prelievo di un frammento di tessuto osseo che contiene il midollo (frammento osseo) che, a differenza dell’aspirato midollare, permette di valutare la densità cellulare, l’insieme del tessuto emopoietico ed il rapporto delle cellule con lo stroma (tessuto di sostegno del midollo) e la eventuale presenza di infiltrazione da parte di cellule estranee. Il prelievo si esegue sulla cresta iliaca posteriore, dopo aver anestetizzato la cute e il tessuto osseo sottostante (si può eseguire anche con anestesia generale). Si inserisce un ago di maggior calibro (ago di Yashmidi) nella profondità dell’osso per un paio di centimetri e si ritira lo strumento all’interno del quale rimane un piccolo frammento cilindrico di tessuto. Il frammento può essere fissato in formalina poi sezionato e valutato da un patologo particolarmente esperto nelle malattie ematologiche.
    La procedura non è molto dolorosa: si può eseguire in regime ambulatoriale o di Day-Hospital, così che il paziente può tornare a casa dopo l’esecuzione.
    Tra le complicanze possibili, ma molto rare sono eventuali ematomi nella sede del prelievo; ancora più rare sono le lesioni ossee o le infezioni nella sede della puntura.

 

la biologia molecolare

La biologia molecolare è una branca recente della biologia. Essa studia, grazie all’uso di tecniche peculiari la struttura e le funzioni del DNA (acido desossiribonucleico) e la formazione di proteine che derivano dai processi di traduzione di questo.
Alla base di tutto ci sono le proprietà della doppia elica del DNA e la possibilità di ibridizzare queste, cioè creare un tratto, una sequenza di DNA che sia complementare alla zona del DNA che cerchiamo. A questo punto si utilizza una sonda molecolare marcata con un isotopo radioattivo che permette l’identificazione del tratto di DNA ricercato. Questa metodica, permette di individuare la presenza di determinate sequenze di DNA all’interno delle cellule o di localizzarne altre sui cromosomi.
 
Le metodiche utilizzate in biologia molecolare sono il Southern blot e la polymerase chain reaction o PCR: con la prima il DNA digerito da processi enzimatici, che permettono così la visione del tratto di DNA interessato, viene fatto correre con il principio dell’elettroforesi su un gel mediante un campo elettrico. Successivamente la sonda marcata si lega al tratto ricercato se presente e con un metodo di autoradiografia è possibile evidenziarlo.
 
La seconda metodica permette di amplificare anche piccoli tratti di DNA ed individuare la lesione molecolare anche con la presenza di poche cellule.
Le indicazioni della biologia molecolare sono: nella diagnostica prenatale e nella diagnostica onco-ematologica. In quest’ultima, le tecniche di biologia molecolare sono divenute di complemento alle tecniche di morfologia, immunologia e citogenetica.
Le malattie nelle quali si applica di routine sono le leucemie acute (specie il tipo promielocitico), la leucemia mieloide cronica e le malattie linfoproliferative croniche.
 
L’identificazione degli eventi molecolari di una patologia ematologica, permettono di:
  • definire differenti sottotipi di leucemia o linfoma con caratteristiche cliniche ben definite ed una prevedibile risposta alla terapia.
  • riconoscere il target (bersaglio) della lesione molecolare per indirizzare nuove terapie mirate (ad es. immunoterapia).
Con l’avvento di queste metodiche sempre più perfezionate, sono sorte anche delle indicazioni terapeutiche diverse; ad esempio, il riconoscimento dell’evento molecolare della leucemia acuta promielocitica, il trascritto PML/RAR alfa tipico di questa varietà di leucemia. Attualmente si parla di remissione molecolare, indicando così la scomparsa completa di questo trascritto evidenziabile con metodiche quali la PCR che permette di osservare la presenza di cellule nell’ordine di 10-4 e di recidiva molecolare indicando così il ripresentarsi della malattia dopo aver ottenuto una remissione molecolare. Studi recenti hanno dimostrato un vantaggio di sopravvivenza nei pazienti che vengono trattati in recidiva molecolare, piuttosto che quando la recidiva è morfologica.

la caratterizzazione immunologica

L’importanza della citofluorimetria nel campo onco-ematologico è andata aumentando negli ultimi decenni in particolare nel campo delle leucemie acute.
Si basa sulla possibilità di riconoscere con delle metodiche di marcatura con immunoglobuline legate a sostanze colorate (fluorocromi), la presenza di antigeni specifici di linea esposti sulla membrana (marcatura di superficie) o di antigeni intracitoplasmatici o endo-nucleari.
Il campione di sangue midollare o periferico, una volta incubato con queste sostanze, viene fatto passare all’interno di una macchina, detta analizzatore di flusso, che permette di leggere la fluorescenza della cellula marcata e la densità di quel particolare antigene che cerchiamo.
La strategia nell’analizzare diversi tipi di patologia, consiste nel formare una porta (“gate”) attraverso cui selezionare solo la popolazione interessata.
 
Gli obiettivi di una analisi citofluorimetrica sono:
  • quantizzare la popolazione patologica e stimare la quota residua normale.
  • porre diagnosi di forma cronica o acuta in base all’espressione di alcuni antigeni caratteristici, sulla base del livello di maturazione di questi, in maniera concorde con l’analisi microscopica.
  • ricerca di forme a carattere prognostico favorevole e/o sfavorevole
  • ricerca di marcatori aberranti, allo scopo di valutare, in remissione morfologica, la malattia minima residua.
A questo scopo si utilizzano sistemi di doppia o tripla marcatura, che consentono di monitorizzare e caratterizzare le cellule neoplastiche.

lo studio del cariotipo in ematologia

Studia la presenza di eventuali alterazioni cromosomiche associate alle patologie ematologiche neoplastiche.
Con l’avvento di nuove tecniche negli ultimi decenni, è stato possibile identificare in maniera più precisa i cromosomi e le singole regioni dei cromosomi. Questo ha permesso di associare in maniera più selettiva e specifica alcune alterazioni cromosomiche ad alcune patologie oncoematologiche.
 
Questo aiuta il clinico nella formulazione della diagnosi e nella classificazione delle leucemie, dei linfomi e delle patologie leucemiche croniche.
Consente inoltre di valutare l’evoluzione della patologia, da indicazioni prognostiche e modula la possibilità di creare strategie terapeutiche.
L’analisi cromosomica si effettua sul tessuto considerato interessato dalla patologia ematologica (il midollo osseo nelle leucemie ed il linfonodo nei linfomi).
Le alterazioni del cariotipo indicano la sede della lesione molecolare che può aver concorso alla formazione del processo neoplastico.
 
Considerando che i cromosomi normali umani sono divisi in 22 paia più la coppia dei cromosomi sessuali X e Y, in termini citogenetici si parla di alterazioni numeriche, quando vi è presente solo un cromosoma della coppia (monosomia), quando uno dei due è duplicato (trisomia); iperdiploidia, quando la cellula osservata che si divide contiene più di 46 cromosomi; ipodiploide, se ne contiene meno di 46; polidiploide, se contiene un multiplo di cromosomi.
 
Si parla invece di alterazioni strutturali, quando vi è:
  • delezione: perdita di una parte di un cromosoma;
  • traslocazione: è il trasferimento di un segmento cromosomico da un cromosoma all’altro.
  • inversione: un segmento cromosomico è invertito rispetto alla sua situazione normale; etc.
Le traslocazioni ad esempio creano dei meccanismi complessi che possono essere responsabili di mutazioni dei geni interessati attraverso diversi meccanismi:
  1. la giustapposizione dei due cromosomi può creare un gene di fusione con particolare funzionalità: è il caso della leucemia mieloide cronica, in cui la traslocazione dei cromosomi 9 e 22 permette la formazione di un gene di fusione detto BCR/ABL che a sua volta permette la formazione di una proteina dotata di un particolare effetto metabolico a livello delle cellule che si replicano. La scoperta di questo meccanismo, ha permesso l’impiego moderno di farmaci che bloccano questa proteina ed il complicato meccanismo metabolico e biologico che ne consegue.
  2. Altre volte il posizionamento di un fattore “oncogenico”, (cioè che può essere implicato nel meccanismo di regolazione della vita cellulare e una volta alterato nella formazione della neoplasia) vicino a zone particolarmente attive di altri cromosomi, fa si che il primo venga tradotto in maniera aberrante, creando uno squilibrio e la formazione del primum movens (processo leucemogenico). E’ il caso delle traslocazioni che coinvolgono il cromosoma 8 a livello di un oncogene detto c-myc: nella forme leucemiche linfoidi queste possono coinvolgere i cromosomi 2, 14, e 22, dove si replicano attivamente i geni per la formazione delle immunoglobuline. In questa maniera il c-myc viene tradotto in maniera aberrante ed influenza il metabolismo cellulare, innescando il processo neoplastico.
L’identificazione delle alterazioni citogenetiche è divenuta di grande utilità nella classificazione e successiva scelta della strategia terapeutica nelle leucemie acute mieloidi e nell’individuazione di alcune forme particolari di leucemia acuta e di sindromi mielodisplastiche.

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